Monoclonal antibodies against an outer membrane protein from pathogenic Leptospira

Two hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAbs) that react with a lipoprotein (LipL32) of the outer membrane of pathogenic Leptospira were obtained. For hybridoma production, spleen cells from BALB/c mice imunized with recombinant LipL32 (rLipL32) were fused to SP2/O-Ag14 cells, selected in HAT medium and screened in an indirect ELISA. One MAb produced was of the IgG2b isotype and the other was an IgM. MAbs specificity was confirmed by indirect ELISA and immunoblotting using purified rLipL32 and whole-cell antigen preparations from Escherichia coli (E. coli) expressing LipL32 and from pathogenic and non-pathogenic serovars. Both Mabs reacted with most of the pathogenic serovars tested and none reacted with non-pathogenic Leptospira. The MAbs described have potential for use in diagnostic tests for leptospirosis.

Foram obtidos dois hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (MAbs) que reagem com uma lipoproteína (LipL32) da membrana externa de leptospiras patogênicas. Para a produção dos hibridomas, células do baço de camundongos BALB/c, imunizados com LipL32 recombinante (rLipL32), foram fusionadas com células SP2/O-Ag14, selecionadas em meio HAT e testadas em ELISA indireto. Um dos MAbs secretados pelos hibridomas é do isotipo IgG2b e o outro do isotipo IgM. A especificidade dos MAbs foi confirmada em ELISA indireto e immunoblotting usando rLipL32 purificada, Escherichia coli (E. coli) expressando LipL32 e sorovares patogênicos e saprófitas. Os dois MAbs reagiram com a maioria dos sorovares patogênicos e não reagiram com sorovares saprófitas. Os MAbs possuem potencial para uso em testes de diagnóstico de leptospirose.

Influence of temperature, incubation time, antigen density and age of the culture in agglutinability of leptospires

In leptospirosis, the Microscopic Agglutination Test (MAT) is the basis of serological diagnosis and the most widely used. In our study, the MAT was applied to evaluate the influence of temperature, incubation time, antigen density and age of the culture in the agglutinability of Leptospires and the interference of these factors in diagnosis. Three serum samples with titers of 100, 800 and 25.600 to the serovar tande (local isolate) of canicola serogroup were used with different combinations among the four factors. There was a significant relation among all factors, specially between the antigen density and age of the culture.

Na leptospirose, o teste de soroaglutinação microscópica (MAT) é a base do diagnóstico sorológico, sendo amplamente usado. Em nosso estudo, o MAT foi aplicado para avaliar a influência da temperatura, tempo de incubação, densidade do antígeno, a idade da cultura na aglutinabilidade das leptospiras e a interferência desses fatores na interpretação do diagnóstico. Três amostras de soro com títulos de 100, 800 e 25600 para o sorovar tande (isolado local), do sorogrupo canicola foram utilizadas com combinações diferentes entre os quatro fatores. Houve uma significante relação entre todos os fatores principalmente a densidade do antígeno e a idade da cultura.

Leptospirosis diagnosis using Nested-PCR

Leptospirosis is a worldwide sanitary problem. Its clinical signs resemble that of other diseases like Dengue and Flu, and it is difficult to distinguish between them. Currently available diagnostic methods shown low sensitivity and specificity. Efforts have been made to develop simpler, faster and more efficient diagnostic methods. The aim of this work was to evaluate and optimize a Nested-PCR method for diagnosis of leptospirosis. Primers were designed to amplify a 264 bp region within the LipL32 gene. The sensitivity and specificity of the assay was evaluated using seven saprophytic serovars and 35 pathogenic serovars. This technique showed to be very specific for pathogenic serovars, however it lacked sensitivity. In order to enhance the sensitivity, another primer pair was designed which amplify a 183 bp region within the 264 bp region in lipL32 gene, and used in a Nested-PCR assay. This approach was much more sensitive than traditional PCR.

A leptospirose constitui um problema sanitário de importância mundial. Esta doença caracteriza-se por apresentar sintomas muito parecidos com os de outras doenças como a dengue e a gripe e, clinicamente é difícil de distingui-las. Técnicas de diagnóstico da leptospirose atualmente disponíveis apresentam baixa sensibilidade e ou especificidade. Por isso, tem havido um grande esforço no sentido de desenvolver testes rápidos e eficientes, baseados em técnicas de biologia molecular. Este trabalho objetivou a avaliação e otimização do Nested-PCR, para o diagnóstico de leptospirose. Para isso foi desenhado um par de primers que amplifica uma região de 264 pb do gene LipL32. A sensibilidade e especificidade do teste foram avaliadas utilizando 7 sorovares saprófitas e 35 sorovares patogênicos. Este PCR mostrou-se específico para leptospiras patogênicas, porém a sensibilidade não foi muito alta. Com o objetivo de melhorar a sensibilidade do teste , foi desenhado outro par de primers que amplifica uma região de 183 pb do gene LipL32, interna a de 264 pb para a realização do Nested-PCR. Nesta reação foi utilizado como DNA molde o produto da primeira amplificação. O Nested-PCR mostrou-se mais sensível que o PCR normal, pois foi capaz de detectar um baixo número de células bacterianas.